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临床致病菌同步PCR阵列(cPCR)检测试剂盒


同步PCR阵列cPCR技术利用材料科学上的进步,使核酸引物合理固化在大分子表面,在超导纳米粒子上进行固态化的反应。由此产生的cPCR是指能在一个相同的温控扩增条件下进行单管多重、多管同步、重复的PCR反应体系;即该阵列在同一温控条件下多个反应管中进行PCR同步扩增,每个反应管内可以进行多重的PCR反应。 

 

Cogradient PCR ArraycPCRpolymerase chain reactions in tubes of a array set can work under a unique program of thermo-cycles

                                                                                                      

 


一、细菌感染性疾病临床的高发疾病

       细菌感染性疾病是临床上发病率最高的疾病之一。从新生儿到老年人,每人每年可患上呼吸道感染一到数次其发病率远超于心血管疾病、肿瘤等疾病的总和。此外,在许多原发疾病的基础上,继发感染是导致死亡直接的原因。

 

二、细菌学诊断目前所面临的挑战

1.一次发病需要辨别的细菌基因数量日益增多;这是由于:

1可能导致感染的细菌种属繁多;例如,呼吸道细菌感染可由多种细菌引起,大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、各种葡萄球菌、肠球菌、鲍曼不动杆菌、链球菌、流感嗜血杆菌、奇异变形杆菌共计10个菌属约40余个致病菌种。

2细菌的各类耐药基因种类繁多,如过半数的金黄色葡萄球菌菌株对苯唑西林、头孢西丁、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松、庆大霉素、红霉素、克林霉素等抗生素不敏感。

3某些细菌携带特殊的毒力因子;如某些金黄色葡萄球菌携带休克毒素(tst),杀白细胞素(pvl),直接影响疾病预后。

因此,临床细菌实验室所采取的每一标本而言,应采用具有快速性的基因扩增检测技术,一般应能达到同步辨析102-103个目标的能力。

2.当前临床细菌检验技术中存在的主要问题是方法的限制

       我国目前诊断试剂市场中微生物诊断试剂所占的比重极低,仅为4-5%。传统的检测技术由细菌培养法、生物化学鉴定法和药敏试验构成。常被说成是从glass-wareplas-ware的繁琐劳累的工作;造成一些细菌检测常规项目,临床难以开展。采用自动化细菌培养仪进行快速、自动化、高通量的分析,其原理仍是基于传统的细菌培养法和生物化学鉴定法,一是价格高昂,二是仍然需要经过增菌-分离-培养鉴定的步骤,检测时间一般仍需72小时以上;无法为早期治疗提供依据。此外,这类方法无法探测细菌的毒力因子。

从方法学方面考虑传统的细菌生化检测技术和分子生物学PCR检测技术在临床细菌鉴别结果上的重叠率为75-80%,宜同时使用、相互补充印证检测结果

3.方法学的创新方向需要建立一种多目标快速同步检测方法,自得到细菌DNA2小时内准确判别临床常见10个菌属大约40病原菌种属、毒力及耐药性做到全方位快速诊断

 

三、目前市场上已有的分子诊断产品

       PCR检测技术依据的是微生物的核酸序列,具有高度准备性和敏感性;但该方法目前也被一些问题困扰。

1.普通荧光PCR试剂:目前市售的试剂盒一般都是对某一特定的目的基因进行扩增,每个试剂盒都有特定的温度循环;普通PCR诊断产品较低的覆盖面无法满足同时进行102-103个目标基因的诊断。
       2.多重PCR试剂:共分两种,一种是一个反应管进行多重(一般58个靶标)反应,但需要开盖,后处理包括进行电泳或分子杂交以识别被扩增的分子,此方法增加了超级气溶胶污染的机会;另一种方法无需开盖,主要依赖对体系内多种荧光标记探针的识别,试剂及仪器的费用较高。多重PCR方法最大的诟病是多重扩增分子在体系中的互不兼容。
       3.Rep-PCR:完成PCR反应后必须进行开盖处理,不但增加污染的几率,还需使用额外的仪器设备和试剂,消耗更多的时间和经费。
       4.基因芯片:特定探针已固化在芯片表面,样本需先经过前处理如荧光标记或PCR扩增,再开盖,芯片上的探针反应。同前面的方法比较,不具显著优势。

 

四、我公司的cPCR阵列技术及其产品的操作模式

       1cPCR采用了温度循环匹配的新型引物体系这种体系使所有的分子扩增反应都遵循一个温控程序,克服了“温度循环条件的多重歧义路径”这一关键性的限制在荧光扩增仪上,一个反应流程即可快速检测102-103个基因目标具有同步解析多个目标的能力也就是说,针对众多目标基因PCR,都可以在任意一台荧光扩增仪器上按表1.所示两个小时之内完成扩增并判定结果如果采用386孔扩增仪,可一小时内完成对10个菌属40个临床常见菌的300多个目标基因的同步检测,一个反应流程即可区分出细菌的多种遗传特性。

 

1. cPCR扩增温度程序

步骤

温度

循环数

预变性

95℃,10 min

1

变性--退火延伸

9515s­--6160s

5

9515s­--6260s

5

9515s­--6460s

5

9515s­--6560s

5

9515s­--6660s

5

9515s­--6760s

15

 

       2 按照细菌的种属、毒力和耐药性,我公司建立一个基因数据库,包括临床常见的10个菌属的全部可探测的相关靶点,涵盖各种致病菌的种属特异性基因、耐药性基因和毒力因子基因

       3 在疾病检测时,可根据种属情况选择相关基因如需要检测的菌属较多,可用两步以节省操作费用,即先作种属测定,依照结果再检测其他项目。具体内容请参考[疾病索引][用户指导手册]

       4 操作仅需使用市场通用的荧光扩增仪,无其他特殊处理或辅助仪器。

       5 方法进行种内分型或分群,了解待检菌致病性的强弱

 

五、cPCR技术及其产品的优势

改变了传统方法耗时(time-consuming)、费力(labor-intensive)的特点

1.操作简便、时间短:样本前处理简单,操作准备 + PCR仅需不到2小时即可完成对常见感染菌的各项诊断;PCR结束后无需开盖

2.利用通用荧光扩增仪添加其他设备。

3.机动灵活:可根据需要自选择待测基因组合;或利用分步法,先作种属测定依照结果再作其他项目,以节省费用

 

如果从费效比的角度考察一个合格的医学检验产品,对医患二者而言其关键在于检验所需的时间费用对检验人员劳动时间操作的繁琐程度是否需要复杂的仪器操作及维护技能。在细菌分子检测领域,cPCR在上述任何一个方面都显著优势有可能取代目前市场上流通产品

 

 

 

ATGeobioTM致病菌cPCR 检测系列价格


检测对象

代码

应选择的产品

规格

企业标准

临床常见菌种属

CB010

临床常见致病菌种属鉴定基因试剂盒

20T

Q/ATGeobio 010-2017

葡萄球菌属

CB008

葡萄球菌属种属鉴定相关基因试剂盒

20T

Q/ATGeobio 008-2017

金黄色葡萄球菌临床致病基因

CB009

金黄色葡萄球菌临床相关基因试剂盒

20T

Q/ATGeobio 009-2017

 

《葡萄球菌属可检测基因数据库》 见“技术文献”板块

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